文献类型： 中文期刊

作者： 曹天行 ¹ ; 刘军龙 ¹ ; 张志刚 ¹ ; 史康妍 ¹ ; 石苗 ¹ ; 关贵全 ¹ ; 李有全 ¹ ; 殷宏 ¹ ; 罗建勋 ¹ ;

作者机构： 1.家畜疫病病原生物学国家重点实验室

关键词： 环形泰勒虫;TA04380蛋白;原核表达;特异性;ELISA方法

期刊名称： 中国寄生虫学与寄生虫病杂志

ISSN： 1000-7423

年卷期： 2022 年 40 卷 003 期

页码： 362-368

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 目的 表达环形泰勒虫的重组TA04380蛋白(rTA04380)并建立酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,初步评价该方法的应用价值.方法 用TMHMM和SignalP对TA04380蛋白进行生物信息学分析,根据GenBank上公布的环形泰勒虫TA04380核苷酸序列设计引物,PCR扩增TA04380基因的截短片段(1~636 bp),构建pET30a(+)-TA04380表达质粒,转化至Rosetta(DE3)感受态细胞,诱导表达并纯化rTA04380蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白表达情况;蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析rTA04380蛋白的反应原性及其与其他牛梨形虫的交叉反应性.以rTA04380蛋白为靶抗原建立检测抗环形泰勒虫抗体的ELISA方法,筛选确定最佳的抗原包被量、血清和二抗的稀释度、孵育时间以及最优的封闭剂;用所建立的ELISA方法检测56份标准环形泰勒虫阴性牛血清和76份标准环形泰勒虫阳性牛血清以确定该检测方法的阈值;分析rTA04380蛋白包被后第1、2、3周ELISA方法的重复性和稳定性;用建立的ELISA检测125份牛血清,并与已报道的基于子孢子表面抗原(SPAG)蛋白的ELISA方法作比较,计算符合率;用建立的ELISA方法检测571份来自9个省(自治区)的牛血清,评价该方法的应用价值.结果 生物信息学分析结果显示,环形泰勒虫TA04380蛋白无信号肽序列,在212~413aa存在4次跨膜区,与东方泰勒虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为55%;PCR扩增片段长636 bp.SDS-PAGE结果显示,rTA04380蛋白主要以包涵体的形式存在,纯化后的rTA04380蛋白相对分子质量(Mr)为31 940;Western blotting分析结果显示,rTA04380蛋白能与抗His的单克隆抗体和环形泰勒虫阳性牛血清反应,与东方泰勒虫、中华泰勒虫、双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫阳性牛血清和健康牛血清无交叉反应.以rTA04380蛋白为抗原建立的ELISA方法,最佳反应条件为:抗原包被浓度为10 μg/ml,1%牛血清白蛋白封闭1 h,1∶100稀释的血清孵育1 h,1∶6 000稀释的兔抗牛HRP-IgG孵育1 h;检测阈值为16.9%,敏感性和特异性分别为93.4%和96.4%,假阳性率为3.6%.用所建立的ELISA方法与基于SPAG蛋白的ELISA方法检测牛血清样品的阳性率分别是54.4%(68/125)和49.6%(62/125),符合率为85.6%.用所建立的ELISA方法检测来自9个省(自治区)的571份牛血清样品,总阳性率为43.1%(246/571),其中阳性率由高到低依次为吉林(85.7%,24/28)、宁夏(54.2%,13/24)、贵州(50.0%,13/26)、河南(8/16)、甘肃(43.8%,57/130)、内蒙古(42.2%,35/83)、辽宁(41.1%,30/73)、云南(38.2%,42/110)和青海(29.6%,24/81).结论 成功表达了rTA04380蛋白,建立的ELISA方法敏感性、特异性高,稳定性和符合性良好,具有大规模现场应用的潜在价值.