文献类型： 中文期刊

作者： 王煜 ¹ ; 宋瑞高 ² ; 赵建国 ² ; 王彦芳 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

2.中国科学院动物研究所

关键词： 碱基编辑器;IGF2基因;定点突变;猪胎儿成纤维细胞(PFFs)

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2020 年 011 期

页码： 3427-3435

收录情况： 北大核心

摘要： 本研究旨在利用碱基编辑器在巴马猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast cells,PFFs)中对生长性状相关基因胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)进行高效、精确的定点编辑.通过PCR扩增和测序对巴马猪和大白猪的IGF2基因序列进行鉴定,构建靶向巴马猪的sgRNA-IGF2表达载体,进而通过细胞转染、混合细胞编辑效率检测、单克隆细胞筛选及基因型鉴定等技术手段研究不同碱基编辑器对猪IGF2基因靶点的编辑效率及突变类型.结果显示,巴马猪和大白猪IGF2基因第3内含子存在第3 072 bp处的单核苷酸多态性(SNP)位点,设计靶向巴马猪IGF2基因的单链寡核苷酸序列.单链寡核苷酸经退火后与BsaⅠ线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行重组连接,构建sgRNA-IGF2表达质粒,重组质粒测序结果表明,sgRNA序列已经精确连入U6启动子和sgRNA骨架之间.将rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4种胞嘧啶碱基编辑器分别与sgRNA-IGF2表达质粒共转染至猪胎儿成纤维细胞中,对混合细胞编辑效率进行检测结果表明,对于IGF2基因靶点,hA3A-BE3系列碱基编辑器C到T的编辑效率显著高于rA1-BE3(P<0.05).流式分选、单克隆细胞培养及鉴定结果表明,虽然有71.43%的hA3A-BE3单克隆细胞已被编辑,但有42.86%的细胞存在插入和缺失(indels);hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F的编辑效率(56.86%和40.38%)虽低于hA3A-BE3(71.43%),但是indels的效率也较低(31.37%和21.15%).测序结果分析表明,利用碱基编辑器高效筛选到IGF2基因靶点纯合点突变的单克隆细胞.碱基编辑器作为新的基因编辑工具,可以对猪基因组中与经济性状关联的SNP位点进行高效、精确的基因修饰,为加速猪经济性状的遗传改良提供理论与实践基础.