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耐草甘膦转EPSPS/GAT大豆多重PCR检测体系的建立及应用

文献类型： 中文期刊

作者： 文静 1 ; 郭勇 2 ; 邱丽娟 1 ;

作者机构： 1.东北农业大学农学院

2.中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程/农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室

关键词： 转基因大豆;抗除草剂;外源基因;侧翼序列;多重PCR

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2020 年 020 期

页码： 4127-4136

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [目的]建立一种精准、高效的草甘膦抗性基因G2-EPSPS和GAT的检测方法,为转基因大豆新品系ZH10-6的广泛应用提供技术支持.[方法]根据抗草甘膦大豆ZH10-6和受体中黄10的分子特征,设计大豆内源参考基因(Actin)、外源基因(G2-EPSPS和GAT)以及侧翼序列(G2EPSPS-2/ZH10P2和ZH10P1/GAT-2)的特异性引物,通过PCR扩增测试引物的特异性和适用性.调整引物配比、DNA模板量、dNTP含量、退火温度和延伸温度等,筛选该多重PCR体系的最适扩增条件.将转基因大豆ZH10-6和受体中黄10的基因组DNA按质量比混合,制备成100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%和0的DNA样品,进行灵敏度检测.运用建立的多重PCR体系检测转基因大豆ZH10-6不同地理来源的11份衍生品系,并根据鉴定结果对该体系的应用性进行评价.[结果]建立的多重PCR方法中引物GmActin11 F/R、G2-EPSPS F/R、GAT F/R、ZH10P1/GAT和G2/ZH10P2可分别扩增出转基因大豆ZH10-6大小为126、430、338、810和1 626 bp的特异性目标条带.用该方法扩增受体中黄10时,除了GmActin11 F/R可以扩增出126 bp目标条带,侧翼序列上游引物ZH10P1和下游引物ZH10P2也可以扩增出632 bp目标条带.多重PCR最适扩增体系为DNA模板量100 ng、5 U·μL-1 Ex Taq 0.2μL、10*ExTaq Buffer 2.5μL、2.5 mmol·L-1 dNTP 2μL、10μmol·L-1引物(GmActin11 F/R 0.4μL、G2-EPSPS F/R 0.6μL、GAT F/R 0.4μL、ZH10P1/GAT 0.6μL和G2/ZH10P20.6μL),ddH2O补足25μL.多重PCR扩增最适程序为95℃5 min;95℃30 s,60℃30 s,68℃1 min 20 s,35个循环;72℃12 min.该多重PCR体系灵敏度为0.5%,符合欧盟有关转基因产品标识的要求.该多重PCR方法特异性很强,可以成功检测受体中黄10、转基因大豆ZH10-6及ZH10-6不同地理来源的11个衍生品系.[结论]建立的转EPSPS/GAT大豆多重PCR检测体系具有高通量、特异性强、操作简便和应用广泛的优点,并且能够快速、准确地检测转基因大豆ZH10-6及其衍生品系.

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