文献类型： 中文期刊

作者： 王坤鹏 ¹ ; 尹伊 ² ; 杨新梅 ² ; 刘津月 ² ; 李梦思 ² ; 李娜 ² ; 王少辉 ² ; 鲍衍清 ² ; 张广冻 ² ; 祁晶晶 ² ; 黄勇 ¹ ; 田明星 ² ;

作者机构： 1.四川农业大学动物医学院

2.中国农业科学院上海兽医研究所

关键词： 分裂绿色荧光蛋白;布鲁氏菌;分泌蛋白;鉴定

期刊名称： 微生物学通报

ISSN： 0253-2654

年卷期： 2025 年 52 卷 009 期

页码： 4303-4315

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【背景】布鲁氏菌（Brucella）作为一种兼性胞内寄生菌，可通过分泌效应蛋白修饰宿主细胞多重信号通路帮助其完成胞内增殖。因此，分泌效应蛋白的鉴定对于阐明布鲁氏菌致病机制至关重要。细菌分泌效应蛋白的鉴定方法通常有融合标签法和酶标记技术，但其操作步骤烦琐、成本昂贵。【目的】基于双分子荧光互补技术开发一种简单便捷的质粒系统，用来鉴定布鲁氏菌的分泌效应蛋白。【方法】基于分裂绿色荧光蛋白（split green fluorescent protein, split-GFP）技术，首先，构建真核表达质粒pMAX-sfGFP_1-10-IRES-NLS-tagBFP，该质粒能在转染的细胞中表达sfGFP_1-10蛋白片段，同时具有核定位信号的BFP蛋白能指示转染成功的细胞；之后，构建能在布鲁氏菌中融合表达4×GFP₁₁蛋白的pMCRt-mCherry-P31-4×GFP₁₁-Flag质粒。最后，通过布鲁氏菌分泌效应蛋白BspA和BPE123以及阴性蛋白GST验证split-GFP系统的可行性。【结果】荧光显微镜观察转染pMAX-sfGFP_1-10-IRES-NLS-tagBFP质粒的HeLa细胞，表明tagBFP和sfGFP_1-10蛋白成功表达；蛋白免疫印迹试验证明布鲁氏菌BspA、BPE123及GST成功与4×GFP₁₁-Flag融合表达；细胞感染和荧光显微镜观察结果表明split-GFP能成功指示BspA和BPE123的分泌活性，而阴性分泌蛋白GST无分泌活性。【结论】本研究基于split-GFP技术构建的双质粒系统能成功验证布鲁氏菌效应蛋白的分泌活性，为布鲁氏菌分泌蛋白的鉴定提供了一种新的工具。