文献类型： 中文期刊
作者： 田兴华 1 ; 王梦佳 2 ; 潘登科 3 ;
作者机构： 1.河南大学生命科学学院生化与分子生物学实验室;河南省开封市求实高中;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室
2.;河南大学生命科学学院生化与分子生物学实验室;河南省开封市求实高中;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室
3.;河南大学生命科学学院生化与分子生物学实验室;河南省开封市求实高中;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室;
关键词： 异种移植;血栓调节蛋白;特异性表达;五指山小型猪
期刊名称： 农业生物技术学报
ISSN： 1674-7968
年卷期： 2018 年 04 期
页码： 556-563
收录情况： 北大核心 ; CSCD
摘要： 生理条件下,血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)可与凝血酶结合成复合物,该复合物既可通过激活蛋白C达到抗凝和促纤溶作用;又可经内皮细胞胞吞,通过细胞内溶酶体降解、清除体内凝血酶。另外,TM可与凝血因子Xa特异性结合,抑制凝血酶原的活化,进而使凝血酶的生成速率明显降低。移植后,猪(Sus scrofa)的血管暴露在人(Homo sapiens)血液中,猪TM无法与人的凝血酶发生结合从而使凝血功能紊乱,因此,在猪体内表达人TM是目前解决凝血功能异常的一个新的思路。本研究制备了血管内皮特异性表达人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的转基因克隆猪,研究了hTM在五指山小型猪血管内皮细胞表达情况。利用Red重组系统从细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)上抓捕获得猪的内源TM启动子。PCR扩增获得hTM的c DNA及牛生长素Poly A(b GHp A)序列,依次酶切连入p Blue ScriptⅨSK(-),构建血管内皮特异性表达hTM的载体。获得的载体p BS-hTM-puro经XhoⅨ线性化,电转染五指山小型猪胎儿成纤维细胞,经1.0μg/m L嘌呤霉素筛选10~15 d得到339个转hTM基因的阳性克隆,取两个生长较好的克隆用于核移植,随后获得重构胚972枚。胚胎移植后产仔猪5头;其中4头经基因组DNA、组织RT-PCR检验为阳性,Western blot结果显示hTM为血管内皮细胞特异性表达。成功获得可特异性表达hTM转基因细胞系及转基因克隆猪,为解决异种器官移植后出现的凝血紊乱问题提供了资料基础。
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