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绵羊泰勒虫LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

文献类型： 中文期刊

作者： 张盈 1 ; 曹杰 2 ; 周勇志 2 ; 王亚楠 2 ; 张厚双 2 ; 段德勇 1 ; 周金林 2 ;

作者机构： 1.湖南农业大学动物医学院

2.中国农业科学院上海兽医研究所

关键词： 绵羊泰勒虫;环介导等温扩增;CRISPR/Cas12a检测

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2025 年 47 卷 005 期

页码： 487-493

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 环介导等温扩增技术(LAMP)是一种广泛应用的恒温下快捷检测技术,但其极易发生气溶胶污染导致假阳性结果,将LAMP与簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)系统结合可以有效避免假阳性结果.为建立针对绵羊泰勒虫18S rRNA基因的LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法,本研究根据绵羊泰勒虫18S rRNA基因设计LAMP的特异性引物,构建靶基因的质粒标准品作为模板,优化反应条件后建立LAMP方法.进一步将LAMP产物加入CRISPR/Cas12a检测体系作为模板,优化CRISPR/Cas12a检测体系,获得最佳反应体系.结果显示,优化后LAMP方法的最佳反应温度为65℃,最佳反应时间30 min,内外引物浓度比≥6:1时最佳,LAMP-CRISPR/Cas12a的最佳反应体系为Cas12a蛋白与CRISPR RNA(crRNA)浓度比为1:2,探针浓度为2.5 μmol/L.利用建立的LAMP-CRISPR/Cas12a方法检测绵羊泰勒虫、东方泰勒虫、中华泰勒虫、马泰勒虫、驽巴贝斯虫、绵羊无形体、弓形虫的DNA,结果显示仅绵羊泰勒虫为阳性结果,其他病原均为阴性;将构建的质粒标准品10倍倍比稀释(100~107倍)后作为模板,利用该方法检测,结果显示该方法的检测限为4.04 拷贝/μL;于同一时间和不同时间利用该方法检测重组质粒标准品pMD19-T-T.ovis(4.04×103 拷贝/μL~4.04×101 拷贝/μL),分析其重复性,结果显示该方法批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,具有良好的重复性.利用建立的LAMP-CRISPR/Cas12a方法与套式PCR检测临床绵羊血液样品,结果显示二者的阳性符合率达100%(14/14)、阴性符合率96.43%(54/56),总符合率97.14%(68/70).本实验基于绵羊泰勒虫18S rRNA基因首次建立了特异性、敏感性及重复性均良好的LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法,为绵羊泰勒虫病的监测和防控奠定了技术基础.

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