致马属动物流产沙门氏菌通用型间接ELISA抗体检测方法的建立与应用
文献类型: 中文期刊
第一作者: 郭奎
作者: 郭奎;张泽楠;李帅杰;初晓雨;王垚鑫;郭巍;胡哲;王晓钧
作者机构:
关键词: 马流产沙门氏菌病;ompA;通用型;iELISA;诊断
期刊名称: 中国农业科学
ISSN:
年卷期: 2023 年 012 期
页码: 2421-2430
收录情况: 北大核心 ; CSCD
摘要: 【目的】通过筛选引起马流产的4种沙门氏菌(Salmonella)共同的优势抗原,建立一种敏感高、特异强的通用型间接ELISA(iELISA)抗体检测方法,实现对马群中沙门氏菌抗体的快速高通量检测。【方法】首先利用马流产沙门氏菌阳性血清、阴性血清分别与马流产沙门氏菌全菌抗原进行免疫共沉淀(pull down)试验,筛选出马流产沙门氏菌优势抗原;根据质谱分析结果找到优势抗原基因,将优势抗原基因与其他3种致马流产沙门氏菌病的鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌进行序列比对验证其保守性;其次根据抗原性分析对优势抗原编码基因进行分段表达,设计3对引物,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增沙门氏菌优势抗原基因并将其分别克隆至原核表达载体pET28a;测序分析后将构建正确的重组质粒分别转化入大肠杆菌(Escherichia coli E.coli)Rosetta(DE3)中并加入0.6 mmol·L-1异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,观察蛋白的表达形式;蛋白纯化后通过Western blot验证蛋白的反应原性和广谱性;然后利用纯化后蛋白作为包被抗原,通过对包被抗原量、血清和第二抗体浓度等条件进行优化建立马流产沙门氏菌病间接ELISA抗体诊断方法,并对该方法的特异性、敏感性进行评估。最后将该方法应用于试验感染马血清及临床样本的检测,并将检测结果同凝集试验结果比较。【结果】筛选出的马流产沙门氏菌优势抗原是ompA(Outer Membrane Protein, OMP),通过序列比对,该蛋白氨基酸序列与同属鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌同源性99.4%—100%,具有很好的保守性;PCR扩增后成功获得3条与预期符合的目的基因;成功构建了pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA33个重组质粒。SDS-PAGE结果表明,在24℃、0.6 mmol·L-1 IPTG诱导5 h下,含有pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA3的重组菌均表达了相应蛋白,其中重组ompA1和ompA2蛋白以包涵体形式表达,重组ompA3蛋白以可溶性形式表达;Western blot显示,重组蛋白ompA3可与马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌阳性血清发生特异性反应,证明重组ompA3蛋白具有良好的反应原性,可以作为沙门氏菌属抗血清检测用抗原;以ompA3蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,在最大P/N比确定的最佳反应条件如下:最佳包被抗原浓度为1μg·mL-1,待检血清(1﹕200)37℃作用1 h,酶标抗马二抗(1﹕10 000稀释),TMB在37℃孵育10 min,待检血清OD450>0.143判定为阳性,特异性试验结果显示,该包被抗原与常见马传染病阳性血清无交叉反应。通过对沙门氏菌静脉注射感染马的血清样品进行抗体检测,iELISA可以持续监测抗体阳性到116 d,相比微量凝集(69 d)多监测了47 d,因此iELISA具有更好的敏感性。利用建立的iELISA方法对8个不同牧场180份血清进行抗体检测,其抗体平均阳性检出率为63.3%,比微量凝集阳性检出率高53.9%。【结论】成功筛选到了马流产沙门氏菌病4种病原的共同优势抗原ompA,实现了对该蛋白的可溶性表达,建立了马流产沙门氏菌病通用型iELISA抗体诊断方法,该方法可以实现对临床样本马流产沙门氏菌抗体的检测,该方法具有特异性强、敏感性高,可以作为马流产沙门菌病抗体检测的一种有效工具。
分类号: S852.61
- 相关文献
[1]鸭疫里氏杆菌PCR方法初步建立及应用. 孙龚,郭东春,刘家森,姜骞,司昌德. 2011
[2]口蹄疫病毒通用型金标检测试纸条诊断方法的建立. 任维维,梁仲,智晓莹,祁光宇,刘湘涛,才学鹏,蒋韬. 2012
[3]我国通用型联合收割机现状与发展思考. 王刚,吴崇友,伍德林. 2013
[4]洋葱通用型愈伤组织诱导的建立. 杨海峰,惠林冲,陈微,李威亚,何林玉,王江英,陈振泰,缪美华,潘美红,刘冰江. 2020
[5]牛分枝杆菌细胞壁相关蛋白表达及免疫原性分析. 亓英芳,杜艳芬,刘慧芳,赫明雷,司微,倪洪波,王春来,刘思国. 2009
[6]几种布鲁氏菌病血清学诊断方法的比较研究. 范伟兴,钟旗,何倩倪,吴冬玲,蔡一飞,赵智香. 2006
[7]奶牛衣原体ompA基因的克隆及序列分析. 宋竹青,魏彦明,周继章,曹小安,王光华,邱昌庆. 2009
[8]副溶血弧菌ompA基因缺失株的生物学特性及致病性分析. 白雪瑞,王权,陈永军,万莹,凌娇,王亚磊,蒋蔚. 2018
[9]犬瘟热病毒N基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及应用. 冯佩平,张蕾,柴秀丽,张海玲,赵建军,胡博,白雪,高晗,邵西群,闫喜军,赵权,徐磊. 2012
[10]副溶血弧菌SH112株OmpA蛋白的高效表达及免疫学特性. 王亚磊,王权,白雪瑞,别闯南,陈兆国,韩先干,蒋蔚. 2019
[11]鼠伤寒沙门菌ompA基因缺失株的构建及生物学特性的分析. 张家莉,段世宇,令狐远凤,潘永,杨琦. 2022
[12]三种血清学方法检测牦牛布鲁氏菌病的比较. 李金平,郭会玲,薛晓波,薛晶,吐尔洪·努尔,马俊杰,易新萍. 2014
[13]基于H蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体间接ELISA检测方法的建立. 钱榜,李彦敏,朱学亮,张学燕,Niyokwishimira Alfred,窦永喜,张志东. 2021
[14]几种布鲁氏菌ELISA抗体试剂盒对牛血清的临床检测评价. 叶锋,刘丽娅,马晓菁,谢彩云,谷文喜,马俊杰,易新萍,钟旗. 2021
[15]浅议猪传染性胸膜肺炎及其防治. 张国权,王国艳,王志宇. 2017
[16]东毕吸虫病的研究进展(综述). 魏佳,何国声,姚宝安. 2005
[17]猪流行性腹泻的诊断技术及预防策略. 照日格图,王振普,李志国. 2013
[18]鲟鱼腹水综合症疾病诊断及防治技术. 罗钦,陈玉坤,饶秋华,涂杰峰,罗土炎. 2014
[19]猪圆环病毒病诊断与综合防控技术. 陈秋勇,王隆柏,车勇良,陈如敬,吴学敏,王晨燕,刘玉涛,周伦江. 2017
[20]浅谈猪乙型脑炎的防治. 段正赢,周丹娜,郭锐,杨克礼,刘泽文,袁芳艳,刘威,田永祥. 2015
作者其他论文 更多>>
-
马疱疹病毒2型研究进展
作者:杨燕;郭奎;张泽楠;李帅杰;孟克;胡哲;王晓钧
关键词:马疱疹病毒2型;病原学;流行病学;临床症状;检测方法
-
马传染性子宫炎研究进展
作者:周冰倩;杜承;王晓钧
关键词:马传染性子宫炎;马生殖泰勒菌;检测方法
-
马属动物轮状病毒检测方法研究进展
作者:张泽楠;郭奎;王金慧;李帅杰;胡哲;王晓钧
关键词:马轮状病毒;检测方法;传统检测方法;分子生物学检测方法;免疫学检测方法
-
基于单克隆抗体的非洲马瘟病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与应用
作者:郭奎;张泽楠;王垚鑫;李帅杰;初晓雨;郭巍;胡哲;王晓钧
关键词:非洲马瘟病毒;单克隆抗体;间接ELISA;应用
-
我国马、驴流产沙门氏菌病的研究进展
作者:胡哲;郭奎;王金慧;初晓雨;王垚鑫;王晓钧
关键词:
-
马MAVS MAb的制备及其应用于EIAV感染机制的初步研究
作者:孙克会;王欣慧;陈克伟;杨光璞;王晓钧;杜承;郝力力
关键词:单克隆抗体;线粒体抗病毒信号蛋白;原核表达;蛋白纯化
-
基于人ANP32A蛋白的C型流感病毒聚合酶纯化及PB2蛋白单克隆抗体的高效制备
作者:屈玉杏;郭兴;韩佳岐;张振宇;王晓钧
关键词:C型流感病毒;PB2;huANP32A;单克隆抗体