玉米大斑病菌实时荧光定量PCR内参基因的筛选与应用

文献类型： 中文期刊

第一作者： 代玉立

作者： 代玉立;刘晓菲;甘林;兰成忠;滕振勇;杨秀娟

作者机构：

关键词： 大斑凸脐蠕孢;实时荧光定量PCR;内参基因;扩增效率;表达稳定性

期刊名称： 农业生物技术学报

ISSN： 1674-7968

年卷期： 2023 年 004 期

页码： 867-882

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 由异宗配合的子囊菌大斑凸脐蠕孢（Exserohilum turcicum）引起的大斑病（northern leaf blight）是我国玉米（Zea mays）和高粱（Sorghum bicolor）生产的重要真菌病害。为筛选适用于玉米大斑病菌实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR; qRT-PCR）的内参基因，本研究以转录延伸因子1α（elongation factor-1α, EF-1α）、新生多肽相关复合物α多肽（nascent-polypeptide-associated complex alpha polypeptide, NACA）、60S核糖体蛋白L2（60S ribosomal protein L2, RPL2）、60S核糖体蛋白L37a（60S ribosomal protein L37a,RPL37A）、泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzyme, UBC）、α微管蛋白（α-tubulin, TUBA）、肌动蛋白（actin,ACT）和β微管蛋白（β-tubulin, TUBB）为候选内参基因，以玉米大斑病菌4个不同菌株、3个不同发育阶段、体内侵染4个不同时期以及苯醚甲环唑胁迫4个不同时间的样品为实验材料，通过qRT-PCR技术测定玉米大斑病菌各候选内参基因在上述不同条件下的表达量，利用geNorm（v3.5）、NormFinder（v0.953）、BestKeeper（v1.0）、Delta-CT以及RefFinder（http://blooge.cn/RefFinder/）等分析方法综合评价候选内参基因的表达稳定性。同时，分别以筛选的稳定性较好和较差的内参基因，分析玉米大斑病菌羊毛甾醇14α去甲基化酶（lanosterol 14α-demethylase, CYP51）基因在苯醚甲环唑胁迫下的表达规律。结果表明，8个候选内参基因的扩增效率范围为90.3%～97.8%（r＞0.99），熔解曲线峰图均为单一峰，符合qRT-PCR的扩增效率要求。TUBA和TUBB适于做玉米大斑病菌不同菌株间基因表达分析的内参基因；RPL2和TUBA是不同发育阶段表达较稳定的内参基因；NACA和TUBA是体内侵染不同时期较理想的内参基因；ACT适于做苯醚甲环唑胁迫不同时间基因表达分析的内参基因。qRT-PCR分析表明，在苯醚甲环唑胁迫下，玉米大斑病菌CYP51基因的表达量随时间的推移显著增加，胁迫24 h时，表达量达到最大，胁迫36 h表达量显著下调（P＜0.05）。以稳定性较好的ACT作为内参基因时，与未胁迫组相比，苯醚甲环唑胁迫可显著诱导玉米大斑病菌CYP51基因上调表达（P＜0.05）。但是，以稳定性较差的TUBB作为内参基因时，得出了2个菌株的CYP51基因表达量相反的结果。本研究为玉米大斑病菌基因表达定量分析提供了有效的校正工具，确保基因定量分析的准确性，为进一步研究玉米大斑病菌抗药基因过表达提供了参考依据。

分类号： S435.131.4

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