文献类型： 中文期刊
作者： 杨宁宁 1 ; 张倩 2 ; 易继海 1 ; 王震 1 ; 陈创夫 1 ;
作者机构： 1.石河子大学动物科技学院人兽共患病重点实验室
2.新疆农垦科学院省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室
关键词： 自噬;巨噬细胞;LC3Ⅱ
期刊名称： 中国兽医学报
ISSN： 1005-4545
年卷期： 2022 年 004 期
页码： 718-723,732
收录情况： 北大核心 ; CSCD
摘要： 通过慢病毒包装系统构建能稳定表达双荧光标记的微管相关蛋白轻链3（mCherry-GFP-LC3Ⅱ）的小鼠巨噬细胞系（RAW264.7）,并探讨布鲁菌感染对自噬溶酶体途径的影响。设计并合成含mCherry-GFP-LC3Ⅱ基因的重组慢病毒表达质粒，将重组质粒与慢病毒包装质粒（pMD2.G和pspa×2.0）共同转染293T细胞，浓缩细胞上清中的病毒，用其感染RAW264.7小鼠巨噬细胞。经嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达mCherry-GFP-LC3Ⅱ的RAW246.7细胞株，用倒置荧光显微镜和流式细胞术分析感染效率。分别用Earle’s平衡盐缓冲液（Earle’s balanced salt solution, EBSS）和布鲁菌M5疫苗株菌株处理该细胞株，激光共聚焦显微镜下观察mCherry-GFP-LC3Ⅱ斑点。成功获得了稳定表达mCherry-GFP-LC3Ⅱ的RAW264.7细胞株，经嘌呤霉素筛选后荧光显微镜和流式细胞仪显示荧光阳性率达90%以上，EBSS和布鲁菌M5疫苗株菌株处理后自噬斑点显著增多。成功构建了能够稳定传代的mCherry-GFP-LC3Ⅱ-RAW264.7细胞株，为后续自噬相关研究建立了可靠的细胞平台。
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